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多個(gè)研究領(lǐng)域依賴于稀有細(xì)胞的分離，例如從人血中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞 ( CTCs )、從母體樣本中分離胎兒細(xì)胞，或在分離低豐度的GFP陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在這些情況下，傳統(tǒng)流式細(xì)胞分選儀的高系統(tǒng)壓力 ( >20psi ) 會(huì)對(duì)損害目標(biāo)細(xì)胞的完整性和活性。高死體積會(huì)造成樣本損失，稀有細(xì)胞的數(shù)量本身就非常有限，這無疑是雪上加霜。此外，高度專業(yè)化的設(shè)備和技術(shù)人員，增加了操作的成本和復(fù)雜性。
單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)Pala基于微流控技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)和液滴分配技術(shù)。可在幾分鐘內(nèi)將單個(gè)細(xì)胞分選并分離到96或384孔板中。低系統(tǒng)壓力 (<2psi ) 可確保輕柔分選，并保持細(xì)胞活力和完整性。為單細(xì)胞分選和分離提供了快速、簡單的解決方案。
01. 實(shí)驗(yàn)步驟
> 稀有細(xì)胞富集
將HEK-293細(xì)胞以0.002%的比例混入到無熒光SP2/0細(xì)胞中 ( 2.8μL HEK-293細(xì)胞加入到500uL SP2/0中) 制備模擬稀有細(xì)胞群。在此細(xì)胞群中，預(yù)計(jì)有10個(gè)FITC信號(hào)值大于100的HEK-293細(xì)胞。進(jìn)行富集時(shí)，利用FITC通道作為觸發(fā)器，觸發(fā)值為100。其它設(shè)門參數(shù)參照各組的分析數(shù)據(jù)。
96孔板A1孔預(yù)先加入150μL培養(yǎng)基進(jìn)行富集細(xì)胞收集。在富集過程中，將1μL的一滴液滴到載玻片上，在顯微鏡下檢測陽性細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)一滴中總共含有10個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)呈GFP陽性。將富集后A1孔中樣品 ( 少于200μL ) 轉(zhuǎn)移至新芯片中，用100μL培養(yǎng)基清洗兩遍A1孔，并將清洗液同樣轉(zhuǎn)移至新芯片中。
> 對(duì)富集后稀有細(xì)胞分離
利用單細(xì)胞分選模式分選單個(gè)熒光細(xì)胞，將前向散射光 ( FSC ) 通道作為激發(fā)器，激發(fā)水平為FSC50。為排除芯片之間的微小差別，將FITC下限設(shè)為90而不是之前的100，其它設(shè)門數(shù)據(jù)參照之前的設(shè)置。單個(gè)GFP陽性細(xì)胞分布到預(yù)加150μL培養(yǎng)基的96孔板中。單個(gè)細(xì)胞利用顯微鏡進(jìn)行驗(yàn)證，克隆培養(yǎng)14天。
02. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）模擬稀有細(xì)胞樣本包含500,000個(gè)SP2/0細(xì)胞和僅有10個(gè)GFP陽性HEK-293細(xì)胞 ( 0.002% ）。富集后，目標(biāo)群體在分離池中的頻率為10%，增加了5000倍。
（2）通過明場和熒光顯微鏡檢查，確認(rèn)從富集中恢復(fù)了7個(gè)GFP陽性HEK-293細(xì)胞，富集效率為70%。
（3）在單細(xì)胞分離后，96孔板中識(shí)別出7個(gè)中的4個(gè)GFP陽性HEK-293細(xì)胞，單細(xì)胞分離效率為40%。14天的單細(xì)胞擴(kuò)增確認(rèn)了GFP陽性細(xì)胞的克隆增殖。
03. 單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)Pala的優(yōu)勢
（1）溫和的操作條件：在低壓環(huán)境下操作 (＜2psi )，這有助于保護(hù)細(xì)胞的完整性和活性，避免因高壓造成的細(xì)胞損傷。
（2）靈活的分離模式：單細(xì)胞分離模式，富集分離模式，大量細(xì)胞分離模式，滿足不同應(yīng)用需求。
（3）高效的分離速度：僅需1min即可完成將單細(xì)胞分離至96孔板中，6min可實(shí)現(xiàn)分離至384孔板。
（4）極低的死體積：近乎零的死體積，這有助于最大限度地減少樣本損失，特別是在處理稀有或珍貴的細(xì)胞樣本。
（5）適用于小樣本量：即使從很少的細(xì)胞開始 ( 如100個(gè)細(xì)胞 )，單細(xì)胞分配器也能夠進(jìn)行有效的分離和分配。
總之，單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)Pala的兩步法實(shí)現(xiàn)稀有細(xì)胞分離，為傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀器提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的替代方案，這種低壓系統(tǒng)保留了分離細(xì)胞的完整性和活性，利于分離的克隆細(xì)胞健壯生長。
* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號(hào)
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